Analiza leukocytów w pełnej krwi jest rutynowym testem w laboratorium klinicznym lub banku krwi.Stężenie i żywotność leukocytów są istotnym wskaźnikiem kontroli jakości przechowywania krwi.Poza leukocytami, krew pełna zawiera dużą liczbę płytek krwi, czerwonych krwinek lub szczątków komórkowych, co uniemożliwia analizę pełnej krwi bezpośrednio pod mikroskopem lub w jasnym polu licznika komórek.Konwencjonalne metody liczenia białych krwinek obejmują proces lizy RBC, który jest czasochłonny.
Zliczanie AOPI Dual-fluoresces jest typem testu używanym do wykrywania stężenia i żywotności komórek.Roztwór jest połączeniem oranżu akrydyny (barwnik kwasu nukleinowego o zielono fluorescencyjnym zabarwieniu) i jodku propidyny (barwnik kwasu nukleinowego o czerwonej fluorescencji).Jodek propidyny (PI) jest barwnikiem wykluczającym błonę, który przenika tylko do komórek z uszkodzonymi błonami, podczas gdy oranż akrydyny jest w stanie przeniknąć do wszystkich komórek w populacji.Gdy oba barwniki są obecne w jądrze, jodek propidyny powoduje zmniejszenie fluorescencji oranżu akrydyny poprzez transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET).W rezultacie komórki jądrzaste z nienaruszonymi błonami barwią się na zielono fluorescencyjnie i są liczone jako żywe, podczas gdy komórki jądrzaste z uszkodzonymi błonami barwią tylko na czerwono fluorescencyjnie i są liczone jako martwe przy użyciu systemu Countstar® Rigel.
Countstar Rigel jest idealnym rozwiązaniem dla wielu złożonych testów charakteryzujących populację komórek, umożliwia szybką analizę białych krwinek w pełnej krwi.
Procedura eksperymentalna:
1.Pobierz 20 µl próbki krwi i rozcieńcz ją w 180 µl PBS.
2.Dodaj 12µl roztworu AO/PI do 12µl próbki, delikatnie wymieszaj pipetą;
3. Wciągnąć 20 µl mieszaniny do szkiełka komory;
4. Pozwól komórkom osiąść w komorze przez około 1 minutę;
5. Włóż slajd do instrumentu Countstar FL;
6. Wybierz test „AO/PI Viability”, a następnie wprowadź identyfikator próbki dla tej próbki.
7. Wybierz Rozcieńczenie, Typ komórki, kliknij 'Run', aby rozpocząć test.
Uwaga: AO i PI są potencjalnymi czynnikami rakotwórczymi.Zaleca się, aby operator nosił osobiste wyposażenie ochronne (PPE), aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą i oczami.
Wynik:
1. Obraz jasnego pola pełnej krwi
Na jasnym obrazie pola całej krwi, WBC nie są widoczne wśród krwinek czerwonych.(Rysunek 1)
Rycina 1 Obraz w jasnym polu pełnej krwi.
2. Obraz fluorescencyjny pełnej krwi
Barwniki AO i PI są barwnikami DNA w jądrze komórkowym komórek.Dlatego płytki krwi, czerwone krwinki lub szczątki komórkowe nie są w stanie wpływać na stężenie leukocytów i wynik żywotności.Żywe leukocyty (zielony) i martwe leukocyty (czerwony) są łatwo widoczne na obrazach fluorescencyjnych.(Rysunek 2)
Rycina 2 Obrazy fluorescencyjne pełnej krwi.(A).Obraz kanału AO;(B) Obraz kanału PI;(C) Połącz obrazy kanałów AO i PI.
3. Stężenie i żywotność leukocytów
Oprogramowanie Countstar FL automatycznie zlicza komórki z trzech przekrojów komory i oblicza średnią wartość całkowitej liczby komórek WBC (1202), stężenia (1,83 x 106 komórek/ml) i % żywotności (82,04%).Obrazy i dane krwi pełnej można łatwo wyeksportować jako PDF, obraz lub Excel w celu dodatkowej analizy lub archiwizacji danych.
Rysunek 3 Zrzut ekranu oprogramowania Countstar Rigel
