전혈에서 백혈구를 분석하는 것은 임상 실험실이나 혈액 은행에서 일상적인 분석입니다.백혈구의 농도와 생존율은 혈액 저장의 품질 관리로서 중요한 지표입니다.백혈구 외에도 전혈에는 많은 수의 혈소판, 적혈구 또는 세포 파편이 포함되어 있어 현미경이나 명시야 세포 계수기에서 직접 전혈을 분석하는 것이 불가능합니다.백혈구 수를 계산하는 기존의 방법은 시간이 많이 소요되는 RBC 용해 과정을 포함합니다.
AOPI 이중 형광 계수는 세포 농도 및 생존력을 감지하는 데 사용되는 분석 유형입니다.용액은 acridine orange(녹색 형광 핵산 염색)와 propidium iodide(적색 형광 핵산 염색)의 조합입니다.Propidium iodide(PI)는 손상된 막이 있는 세포에만 들어가는 막 배제 염료인 반면, acridine 오렌지는 집단의 모든 세포에 침투할 수 있습니다.두 염료가 핵에 존재할 때 요오드화 프로피듐은 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 아크리딘 오렌지 형광을 감소시킵니다.결과적으로 막이 손상되지 않은 유핵 세포는 형광 녹색으로 염색되어 살아있는 것으로 간주되는 반면, 손상된 막이 있는 유핵 세포는 형광 적색으로만 염색되며 ® Rigel 시스템을 사용할 때 죽은 것으로 간주됩니다.
Countstar Rigel 은 많은 복잡한 세포 집단 특성 분석에 이상적인 솔루션으로, 전혈에서 백혈구를 신속하게 분석할 수 있습니다.
실험적 절차:
1. 혈액 시료 20µl를 취하여 PBS 180µl에 희석합니다.
2. 12µl AO/PI 용액을 12µl 샘플에 추가하고 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
3. 20µl 혼합물을 챔버 슬라이드에 넣습니다.
4. 세포가 약 1분 동안 챔버에 정착되도록 합니다.
5. 슬라이드를 Countstar FL 기기에 삽입합니다.
6. "AO/PI Viability" 분석을 선택한 다음 이 샘플의 샘플 ID를 입력합니다.
7. Dilution ratio, Cell Type을 선택하고 'Run'을 클릭하여 테스트를 시작합니다.
주의: AO와 PI는 잠재적인 발암 물질입니다.작업자가 피부와 눈에 직접 닿지 않도록 개인 보호 장비(PPE)를 착용하는 것이 좋습니다.
결과:
1. 전혈의 명시야 이미지
전혈의 명시야 이미지에서 백혈구는 적혈구 사이에서 보이지 않습니다.(그림 1)
그림 1 전혈의 명시야 이미지.
2. 전혈의 형광 이미지
AO 및 PI 염료는 모두 세포의 세포 핵에 있는 염색 DNA입니다.따라서 혈소판, 적혈구 또는 세포 파편은 백혈구 농도 및 생존 결과에 영향을 줄 수 없습니다.살아있는 백혈구(녹색)와 죽은 백혈구(빨간색)는 형광 이미지에서 쉽게 시각화됩니다.(그림 2)
그림 2 전혈의 형광 이미지.(ㅏ).AO 채널의 이미지;(B) PI 채널의 이미지;(C) AO 및 PI 채널의 이미지를 병합합니다.
3. 백혈구의 농도와 생존율
FL 소프트웨어는 3개의 챔버 섹션의 세포를 자동으로 계산하고 총 WBC 세포 수(1202), 농도(1.83 x 106 cells/ml) 및 % 생존율(82.04%)의 평균값을 계산합니다.전혈 이미지와 데이터는 추가 분석 또는 데이터 보관을 위해 PDF, 이미지 또는 Excel로 쉽게 내보낼 수 있습니다.
그림 3 Countstar Rigel 소프트웨어의 스크린샷
