Анотація: Мезенхімальні стовбурові клітини – це підгрупа плюрипотентних стовбурових клітин, які можна виділити з мезодерми.Завдяки їх характеристикам відновлення саморозмноження та багатонаправленої диференціації вони мають високий потенціал для різних видів терапії в медицині.Мезенхімальні стовбурові клітини мають унікальний імунний фенотип і здатність імунної регуляції.Тому мезенхімальні стовбурові клітини вже широко використовуються в трансплантації стовбурових клітин, тканинної інженерії та трансплантації органів.Крім цих застосувань, вони використовуються як ідеальний інструмент у тканинній інженерії як клітини сівалки в серії фундаментальних і клінічних дослідницьких експериментів.До цього часу не існує широко прийнятого методу та стандарту для контролю якості мезенхімальних стовбурових клітин.Countstar Rigel може контролювати концентрацію, життєздатність і характеристики фенотипу (та їх зміни) під час виробництва та диференціації цих стовбурових клітин.Countstar Rigel також має перевагу в отриманні додаткової морфологічної інформації, яка забезпечується постійним яскравим полем і записами зображень на основі флуоресценції протягом усього процесу моніторингу якості клітини.Countstar Rigel пропонує швидкий, складний і надійний метод контролю якості стовбурових клітин.
Матеріали та методи:
Мезенхімальні стовбурові клітини, отримані з жиру, були подаровані професором Ніанміном Ци, розчином для фарбування AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Антитіла: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (компанія BD).
AdMSC культивували в 37℃, 5% CO2 зволоженому інкубаторі.Перед використанням перетравлюйте з трипсином.
Процедуру фарбування CD-маркерів використовували як інструкцію з антитіла.
Виявлення CD-маркерів за допомогою Countstar Rigel:
1. Процедура застосування кольору сигналу була створена шляхом налаштування каналу PE на зображення флуоресценції PE.
2. З кожної камери було захоплено 3 поля.
3. Після завершення візуалізації та початкового аналізу за допомогою програмного забезпечення FCS було встановлено порогове значення (логарифмічний вентиль) для позитивної та негативної трансфекції.
Контроль якості стовбурових клітин
На наступному малюнку (Малюнок 1) показана процедура терапія стовбуровими клітинами .
Малюнок 1: Процедура терапії стовбуровими клітинами
Результати:
Визначення концентрації, життєздатності, діаметра та агрегації AdMSC.
Життєздатність AdMSC визначали за допомогою AO/PI. Процедура застосування подвійного кольору була створена шляхом встановлення зеленого каналу та червоного каналу на зображення флуоресценції AO та PI, а також яскраве поле.Приклади зображень показані на малюнку 2.
Малюнок 2. Зображення до транспортування та після транспортування AdMSC.A. Перед транспортуванням;показано репрезентативне зображення.B. Після транспортування;показано репрезентативне зображення.
Життєздатність AdMSC різко змінилася після транспортування в порівнянні з до транспортування.Життєздатність до транспортування становила 92%, але після транспортування знизилася до 71%.Результат був показаний на малюнку 3.
Рисунок 3. Результати життєздатності AdMSC (до транспортування та після транспортування)
Діаметр і агрегацію також визначав Countstar Rigel.Діаметр AdMSC був різко змінений після транспортування в порівнянні з до транспортування.Діаметр до транспортування становив 19 мкм, але після транспортування він збільшився до 21 мкм.Агрегація до транспортування становила 20%, але зросла до 25% після транспортування.Зі зображень, зроблених Countstar Rigel, фенотип AdMSC був різко змінений після транспортування.Результати були показані на малюнку 4.
Малюнок 4: Діаметр і результати агрегації.В: Репрезентативні зображення AdMSC, фенотип AdMSC були різко змінені після транспортування.B: Агрегація до транспортування становила 20%, але після транспортування вона зросла до 25%.C: Діаметр до транспортування становив 19 мкм, але після транспортування він збільшився до 21 мкм.
Визначте імунофенотип AdMSC за Countstar Rigel
Імунофенотип AdMSC визначали за допомогою Countstar Rigel, AdMSC інкубували з різними антитілами відповідно (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Процедура застосування кольору сигналу була створена шляхом встановлення зеленого каналу для зображення флуоресценції PE, а також яскравого поля.Сегментація опорного зображення яскравого поля була застосована як маска для вибірки сигналу флуоресценції PE.Були показані результати CD105 (рис. 5).
Малюнок 5: Результати CD105 AdMSC були визначені Countstar Rigel.В: Кількісний аналіз позитивного відсотка CD105 у різних зразках за допомогою програмного забезпечення FCS express 5 plus.B: Високоякісні зображення надають додаткову морфологічну інформацію.C: Перевірені результати за мініатюрами кожної окремої клітини, програмні засоби FCS розділили клітини на різні групи відповідно до їхньої різної експресії білка.
Інші результати антитіл показані на рис. 6
Малюнок 6: A: Репрезентативне зображення ASC з типовою веретеноподібною морфологією.Знято мікроскопом OLYMPUS.Оригінальне збільшення (10x).B: Адипогенна диференціація ASC підтверджується фарбуванням рутенієвим червоним, що показує ділянки мінералізації.Знято мікроскопом OLYMPUS.Оригінальне збільшення (10x).C: Countstar FL характеристика ASC.
Резюме:
Countstar FL може контролювати концентрацію, життєздатність та характеристики фенотипу (та їх зміни) під час виробництва та диференціації цих стовбурових клітин.FCS express надає функцію перегляду кожної сигнальної комірки, перевірки даних через зображення.Користувач також може мати впевненість у проведенні наступних експериментів на основі результатів Countstar Rigel.Countstar Rigel пропонує швидкий, складний і надійний метод контролю якості стовбурових клітин.
