Abstract: Mesenchymale stamcellen zijn een subset van pluripotente stamcellen die uit het mesoderm kunnen worden geïsoleerd.Met hun zelfreplicatievernieuwing en differentiatie in meerdere richtingen, hebben ze een groot potentieel voor verschillende therapieën in de geneeskunde.Mesenchymale stamcellen hebben een uniek immuunfenotype en immuunregulerend vermogen.Daarom worden mesenchymale stamcellen al veel gebruikt bij stamceltransplantaties, weefselmanipulatie en orgaantransplantatie.En afgezien van deze toepassingen, worden ze gebruikt als een ideaal hulpmiddel bij weefselmanipulatie als zaadcellen in een reeks fundamentele en klinische onderzoeksexperimenten.Tot nu toe is er geen algemeen aanvaarde methode en standaard voor de kwaliteitscontrole van mesenchymale stamcellen.De Countstar Rigel kan de concentratie, levensvatbaarheid en fenotypekenmerken (en hun veranderingen) volgen tijdens de productie en differentiatie van deze stamcellen.De Countstar Rigel heeft ook het voordeel bij het verkrijgen van aanvullende morfologische informatie, geleverd door de permanente helderveld- en fluorescentie-gebaseerde beeldopnames tijdens het hele proces van celkwaliteitsbewaking.De Countstar Rigel biedt een snelle, geavanceerde en betrouwbare methode voor de kwaliteitscontrole van stamcellen.
Materialen en methodes:
Van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (AdMSC's) werden geschonken door professor Nianmin Qi, AO / PI-kleuringsoplossing (Shanghai RuiYu, CF002).Antilichaam: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC's werden gekweekt in een bevochtigde incubator van 37 ℃, 5% CO2.Verteren met trypsine voor gebruik.
De procedure voor het kleuren van CD-markers werd gevolgd als de handleiding van antilichaam.
CD marker detectie met Countstar Rigel:
1. Er is een procedure voor het aanbrengen van signaalkleuren gemaakt door het PE-kanaal in te stellen op PE-fluorescentie.
2. Uit elke kamer werden 3 velden gevangen.
3. Nadat de beeldvorming en de eerste analyse waren voltooid, werd de instelling van de drempel (log gate) voor positieve en negatieve transfectie ingesteld door FCS-software.
Kwaliteitscontrole van stamcellen
De volgende afbeelding (Figuur 1) toont de procedure van: stamceltherapie .
Figuur 1: De procedure voor stamceltherapie
Resultaten:
Bepaling van de concentratie, levensvatbaarheid, diameter en aggregatie van AdMSC's.
De levensvatbaarheid van AdMSC's werd bepaald door AO / PI. Er werd een tweekleurige aanvraagprocedure gemaakt door het groene kanaal en het rode kanaal in te stellen op AO- en PI-fluorescentie, plus een helder veld.Voorbeeldafbeeldingen werden getoond in figuur 2.
Figuur 2. Afbeeldingen van voor transport en na transport van AdMSC's.A. Voorafgaand aan transport;een representatief beeld wordt getoond.B. Na transport;een representatief beeld wordt getoond.
De levensvatbaarheid van AdMSC's was drastisch veranderd na transport in vergelijking met voorafgaand aan transport.De levensvatbaarheid vóór transport was 92%, maar daalde tot 71% na transport.Het resultaat werd getoond in figuur 3.
Figuur 3. De levensvatbaarheidsresultaten van AdMSC's (vóór transport en na transport)
De diameter en aggregatie werden ook bepaald door Countstar Rigel.De diameter van AdMSC's was drastisch veranderd na transport in vergelijking met voorafgaand aan transport.De diameter vóór transport was 19 µm, maar nam toe tot 21 µm na transport.De aggregatie van vóór transport was 20%, maar nam toe tot 25% na transport.Uit de afbeeldingen die zijn vastgelegd door Countstar Rigel, was het fenotype van AdMSC's drastisch veranderd na transport.De resultaten werden getoond in figuur 4.
Figuur 4: De diameter en aggregatieresultaten.A: De representatieve afbeeldingen van AdMSC's, het fenotype van AdMSC's waren drastisch veranderd na transport.B: De aggregatie vóór transport was 20%, maar nam toe tot 25% na transport.C: De diameter vóór transport was 19 µm, maar nam toe tot 21 µm na transport.
Bepaal het immunofenotype van AdMSC's door Countstar Rigel
Het immunofenotype van AdMSC's werd bepaald door Countstar Rigel, AdMSC's werden respectievelijk geïncubeerd met verschillende antilichamen (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Er werd een procedure voor het aanbrengen van signaalkleuren gecreëerd door een groen kanaal in te stellen voor het afbeelden van PE-fluorescentie, plus een helder veld.Helderveldbeeldreferentiesegmentatie werd toegepast als een masker om het PE-fluorescentiesignaal te bemonsteren.De resultaten van CD105 werden getoond (Figuur 5).
Figuur 5: CD105-resultaten van AdMSC's werden bepaald door Countstar Rigel.A: Kwantitatieve analyse van het positieve percentage CD105 in verschillende monsters door FCS express 5 plus-software.B: Afbeeldingen van hoge kwaliteit leveren aanvullende morfologische informatie.C: Gevalideerde resultaten door miniaturen van elke afzonderlijke cel, de FCS-softwaretools verdeelden de cellen in verschillende groepen op basis van hun variërende eiwitexpressie.
Andere antilichaamresultaten werden getoond in figuur 6.
Figuur 6: A: een representatief beeld van ASC's met typische spoelvormige morfologie.Gevangen door OLYMPUS-microscoop.Originele vergroting, (10x).B: Adipogene differentiatie van ASC's blijkt uit Ruthenium Red-kleuring die mineralisatiegebieden laat zien.Gevangen door OLYMPUS-microscoop.Originele vergroting (10x).C: Countstar FL-karakterisering van ASC's.
Overzicht:
De Countstar FL kan de concentratie, levensvatbaarheid en fenotypekenmerken (en hun veranderingen) volgen tijdens de productie en differentiatie van deze stamcellen.FCS express levert de functie om elke signaalcel te beoordelen en de gegevens via het beeld te valideren.De gebruiker kan ook het vertrouwen hebben om de volgende experimenten uit te voeren op basis van de resultaten van Countstar Rigel.De Countstar Rigel biedt een snelle, geavanceerde en betrouwbare methode voor de kwaliteitscontrole van stamcellen.
