sažetak: Mezenhimalne matične ćelije su podskup pluripotentnih matičnih ćelija koje se mogu izolovati iz mezoderma.Svojim karakteristikama obnavljanja samoreplikacije i višesmjerne diferencijacije posjeduju veliki potencijal za različite terapije u medicini.Mezenhimalne matične ćelije imaju jedinstven imuni fenotip i sposobnost imunološke regulacije.Stoga se mezenhimske matične ćelije već široko koriste u transplantaciji matičnih ćelija, tkivnom inženjeringu i transplantaciji organa.I pored ovih aplikacija, koriste se kao idealno oruđe u tkivnom inženjeringu kao ćelije za sejanje u nizu osnovnih i kliničkih istraživačkih eksperimenata.Do sada ne postoji široko prihvaćena metoda i standard za kontrolu kvaliteta mezenhimskih matičnih ćelija.Countstar Rigel može pratiti koncentraciju, vitalnost i karakteristike fenotipa (i njihove promjene) tokom proizvodnje i diferencijacije ovih matičnih ćelija.Countstar Rigel takođe ima prednost u dobijanju dodatnih morfoloških informacija, obezbeđenih stalnim svetlosnim poljem i snimcima slike zasnovanim na fluorescenciji tokom celog procesa praćenja kvaliteta ćelija.Countstar Rigel nudi brzu, sofisticiranu i pouzdanu metodu za kontrolu kvaliteta matičnih ćelija.
Materijali i metode:
Mezenhimske matične ćelije dobijene od masnoće (AdMSC) poklonio je profesor Nianmin Qi, rastvor za bojenje AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Antitijelo: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC su uzgajani u 37℃, 5% CO2 vlažnom inkubatoru.Prije upotrebe probaviti s tripsinom.
Procedura bojenja CD markera je praćena kao priručnik za antitela.
Detekcija CD markera sa Countstar Rigelom:
1. Procedura primjene boje signala je kreirana postavljanjem PE kanala na sliku PE fluorescencije.
2. Iz svake komore su zarobljena 3 polja.
3. Nakon što su snimanje i početna analiza završeni, postavka praga (log gate) za pozitivnu i negativnu transfekciju je postavljena pomoću FCS softvera.
Kontrola kvaliteta matičnih ćelija
Sljedeća slika (Slika 1) prikazuje proceduru terapija matičnim ćelijama .
Slika 1: Postupak za terapiju matičnim ćelijama
Rezultati:
Određivanje koncentracije, održivosti, prečnika i agregacije AdMSC-a.
Viabilnost AdMSC-a je određena pomoću AO/PI. Procedura primjene u dvije boje je kreirana postavljanjem zelenog kanala i crvenog kanala na sliku AO i PI fluorescencije, plus svijetlo polje.Primjeri slika prikazani su na slici 2.
Slika 2. Slike prije transporta i nakon transporta AdMSC-a.A. Prije transporta;prikazana je reprezentativna slika.B. Nakon transporta;prikazana je reprezentativna slika.
Održivost AdMSC-a je drastično promijenjena nakon transporta u odnosu na prije transporta.Održivost prije transporta bila je 92%, ali je smanjena na 71% nakon transporta.Rezultat je prikazan na slici 3.
Slika 3. Rezultati održivosti AdMSC-a (prije transporta i nakon transporta)
Prečnik i agregaciju je takođe odredio Countstar Rigel.Prečnik AdMSC-a je drastično promenjen nakon transporta u poređenju sa pre transporta.Promjer prije transporta bio je 19 µm, ali se nakon transporta povećao na 21 µm.Agregacija prije transporta bila je 20%, ali se povećala na 25% nakon transporta.Na osnovu slika koje je snimio Countstar Rigel, fenotip AdMSC-a je drastično promijenjen nakon transporta.Rezultati su prikazani na slici 4.
Slika 4: Prečnik i rezultati agregacije.O: Reprezentativne slike AdMSC-a, fenotip AdMSC-a su drastično promijenjeni nakon transporta.B: Agregacija prije transporta bila je 20%, ali se povećala na 25% nakon transporta.C: Promjer prije transporta bio je 19 µm, ali se nakon transporta povećao na 21 µm.
Odredite imunofenotip AdMSC-a od strane Countstar Rigela
Imunofenotip AdMSC je određen Countstar Rigel, AdMSC su inkubirani sa različitim antitijelima (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Procedura primjene boje signala kreirana je postavljanjem zelenog kanala za sliku PE fluorescencije, plus svijetlo polje.Referentna segmentacija slike svijetlog polja primijenjena je kao maska za uzorkovanje PE fluorescentnog signala.Prikazani su rezultati CD105 (Slika 5).
Slika 5: CD105 rezultate AdMSC-a odredio je Countstar Rigel.O: Kvantitativna analiza pozitivnog procenta CD105 u različitim uzorcima pomoću softvera FCS express 5 plus.B: Visokokvalitetne slike pružaju dodatne morfološke informacije.C: Validirani rezultati pomoću sličica svake pojedinačne ćelije, FCS softverski alati su podijelili ćelije u različite grupe prema njihovoj različitoj ekspresiji proteina.
Ostali rezultati antitijela prikazani su na slici 6
Slika 6: A: Reprezentativna slika ASC sa tipičnom morfologijom u obliku vretena.Snimljeno mikroskopom OLYMPUS.Originalno uvećanje, (10x).B: Adipogena diferencijacija ASC-a je dokazana bojenjem rutenijum crvenom koja pokazuje područja mineralizacije.Snimljeno mikroskopom OLYMPUS.Originalno uvećanje (10x).C: Countstar FL karakterizacija ASC-a.
Sažetak:
Countstar FL može pratiti koncentraciju, vitalnost i karakteristike fenotipa (i njihove promjene) tokom proizvodnje i diferencijacije ovih matičnih ćelija.FCS express pruža funkciju za pregled svake signalne ćelije, validaciju podataka kroz sliku.Korisnik takođe može imati samopouzdanja da izvede sledeće eksperimente na osnovu Countstar Rigel rezultata.Countstar Rigel nudi brzu, sofisticiranu i pouzdanu metodu za kontrolu kvaliteta matičnih ćelija.
