Abstrakt: Mesenkymale stamceller er en undergruppe av pluripotente stamceller som kan isoleres fra mesodermen.Med deres selvreplikasjonsfornyelse og differensieringsegenskaper i flere retninger, har de et høyt potensial for ulike terapier innen medisin.Mesenkymale stamceller har en unik immunfenotype og immunreguleringsevne.Derfor er mesenkymale stamceller allerede mye brukt i stamcelletransplantasjoner, vevsteknikk og organtransplantasjon.Og utover disse applikasjonene, brukes de som et ideelt verktøy i vevsteknikk som seederceller i en serie grunnleggende og kliniske forskningseksperimenter.Til nå er det ikke en allment akseptert metode og standard for kvalitetskontroll av mesenkymale stamceller.Countstar Rigel kan overvåke konsentrasjonen, levedyktigheten og fenotypekarakteristikkene (og deres endringer) under produksjon og differensiering av disse stamcellene.Countstar Rigel har også fordelen med å få ytterligere morfologisk informasjon, levert av permanente lysfelt- og fluorescensbaserte bildeopptak under hele prosessen med cellekvalitetsovervåking.Countstar Rigel tilbyr en rask, sofistikert og pålitelig metode for kvalitetskontroll av stamceller.
Materialer og metoder:
Fettavledede mesenkymale stamceller (AdMSCs) ble gitt av professor Nianmin Qi, AO/PI-fargeløsning (Shanghai RuiYu, CF002).Antistoff: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSCs ble dyrket i en 37 ℃, 5 % CO2 fuktet inkubator.Fordøys med trypsin før bruk.
CD-markørfargingsprosedyre ble fulgt som manualen for antistoff.
CD-markørdeteksjon med Countstar Rigel:
1. En signal-farge-påføringsprosedyre ble opprettet ved å sette PE-kanalen til å avbilde PE-fluorescens.
2. 3 felt ble fanget fra hvert kammer.
3. Etter at avbildning og innledende analyse var fullført, ble terskelinnstillingen (loggport) for positiv og negativ transfeksjon satt av FCS-programvaren.
Kvalitetskontroll av stamceller
Følgende figur (Figur 1) viser fremgangsmåten for stamcelleterapi .
Figur 1: Fremgangsmåten for stamcelleterapi
Resultater:
Bestemme konsentrasjonen, levedyktigheten, diameteren og aggregeringen av AdMSCs.
Levedyktigheten til AdMSC-er ble bestemt av AO/PI. En påføringsprosedyre med to farger ble opprettet ved å sette Grønn kanal og Rød kanal til å avbilde AO- og PI-fluorescens, pluss et lyst felt.Eksempelbilder ble vist i figur 2.
Figur 2. Bilder av før transport og etter transport av AdMSCs.A. Før transport;et representativt bilde vises.B. Etter transport;et representativt bilde vises.
Levedyktigheten til AdMSC-er ble drastisk endret etter transport sammenlignet med før transport.Levedyktigheten før transport var 92 %, men den reduserte til 71 % etter transport.Resultatet ble vist i figur 3.
Figur 3. Levedyktighetsresultatene til AdMSCs (før transport og etter transport)
Diameteren og aggregeringen ble også bestemt av Countstar Rigel.Diameteren til AdMSC-er ble drastisk endret etter transport sammenlignet med før transport.Diameteren før transport var 19 µm, men den økte til 21 µm etter transport.Aggregeringen av før transport var 20 %, men den økte til 25 % etter transport.Fra bildene tatt av Countstar Rigel ble fenotypen til AdMSC-er drastisk endret etter transport.Resultatene ble vist i figur 4.
Figur 4: Diameteren og aggregeringsresultatene.A: De representative bildene av AdMSC-er, fenotypen til AdMSC-er, ble drastisk endret etter transport.B: Aggregeringen før transport var 20 %, men den økte til 25 % etter transport.C: Diameteren før transport var 19 µm, men den økte til 21 µm etter transport.
Bestem immunfenotypen til AdMSCs av Countstar Rigel
Immunfenotypen til AdMSC-er ble bestemt av Countstar Rigel, AdMSC-er ble inkubert med henholdsvis forskjellige antistoffer (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).En signal-farge påføringsprosedyre ble opprettet ved å sette en grønn kanal for å avbilde PE-fluorescens, pluss et lyst felt.Bright field bildereferansesegmentering ble brukt som en maske for å prøve PE-fluorescenssignalet.Resultatene av CD105 ble vist (figur 5).
Figur 5: CD105-resultater av AdMSCs ble bestemt av Countstar Rigel.A: Kvantitativ analyse av den positive prosentandelen av CD105 i forskjellige prøver med FCS express 5 plus-programvare.B: Bilder av høy kvalitet gir ytterligere morfologisk informasjon.C: Validerte resultater med miniatyrbilder av hver enkelt celle, FCS-programvareverktøyene delte cellene inn i forskjellige grupper i henhold til deres varierende proteinuttrykk.
Andre antistoffresultater ble vist i figur 6
Figur 6: A: Et representativt bilde av ASC-er med typisk spindelformet morfologi.Fanget med OLYMPUS mikroskop.Original forstørrelse, (10x).B: Adipogen differensiering av ASC er dokumentert ved Ruthenium Red-farging som viser områder med mineralisering.Fanget med OLYMPUS mikroskop.Opprinnelig forstørrelse (10x).C: Countstar FL-karakterisering av ASC-er.
Sammendrag:
Countstar FL kan overvåke konsentrasjonen, levedyktigheten og fenotypekarakteristikkene (og deres endringer) under produksjon og differensiering av disse stamcellene.FCS express leverer funksjonen for å gjennomgå hver signalcelle, validere dataene gjennom bildet.Brukeren kan også ha tillit til å utføre de neste eksperimentene basert på Countstar Rigel-resultater.Countstar Rigel tilbyr en rask, sofistikert og pålitelig metode for kvalitetskontroll av stamceller.
