Absztrakt: A mezenchimális őssejtek a mezodermából izolálható pluripotens őssejtek egy részhalmaza.Önreplikáció-megújító képességükkel és többirányú differenciálódási jellemzőikkel nagy potenciállal rendelkeznek az orvostudomány különféle terápiáiban.A mezenchimális őssejtek egyedi immunfenotípussal és immunszabályozó képességgel rendelkeznek.Ezért a mezenchimális őssejteket már széles körben használják az őssejt-transzplantációban, a szövettervezésben és a szervátültetésben.Ezeken az alkalmazásokon túlmenően ideális eszközként használják a szövetfejlesztésben, mint vetősejteket számos alap- és klinikai kutatási kísérlet során.Ez idáig nem létezik széles körben elfogadott módszer és szabvány a mesenchymális őssejtek minőségellenőrzésére.A Countstar Rigel képes nyomon követni ezen őssejtek koncentrációját, életképességét és fenotípus jellemzőit (és ezek változását) ezen őssejtek termelése és differenciálódása során.A Countstar Rigel előnye az is, hogy további morfológiai információkhoz jut, amelyeket az állandó fényes tér és fluoreszcencia alapú képfelvételek biztosítanak a sejtminőség monitorozás teljes folyamata során.A Countstar Rigel gyors, kifinomult és megbízható módszert kínál az őssejtek minőség-ellenőrzésére.
Anyagok és metódusok:
A zsírból származó mezenchimális őssejteket (AdMSC) Nianmin Qi professzor ajándékozta AO/PI festőoldattal (Shanghai RuiYu, CF002).Antitest: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
Az AdMSC-ket 37 ℃-os, 5% CO2 párásítású inkubátorban tenyésztettük.Használat előtt tripszinnel felemészteni.
A CD marker festési eljárást követték az antitest kézikönyveként.
CD marker felismerés Countstar Rigel segítségével:
1. Létrehoztunk egy jel-szín alkalmazási eljárást úgy, hogy a PE csatornát kép PE fluoreszcenciára állítottuk.
2. Minden kamrából 3 mezőt vettünk fel.
3. A képalkotás és a kezdeti elemzés befejezése után a pozitív és negatív transzfekció küszöbértékét (log-gate) állítottuk be FCS szoftverrel.
Az őssejt minőség-ellenőrzése
A következő ábra (1. ábra) mutatja az eljárást őssejtterápia .
1. ábra: Az őssejtterápia eljárása
Eredmények:
Az AdMSC-k koncentrációjának, életképességének, átmérőjének és aggregációjának meghatározása.
Az AdMSC-k életképességét AO/PI-vel határoztuk meg. Kétszínű alkalmazási eljárást hoztak létre úgy, hogy a Green csatornát és a Red csatornát a kép AO és PI fluoreszcenciájára, valamint egy világos mezőre állítottuk be.Példaképek a 2. ábrán láthatók.
2. ábra: Az AdMSC-k szállítása előtti és utáni képei.A. Szállítás előtt;reprezentatív kép látható.B. Szállítás után;reprezentatív kép látható.
Az AdMSC-k életképessége a szállítás után drasztikusan megváltozott, összehasonlítva a szállítás előtti állapotokkal.Az életképesség a szállítás előtt 92%-os volt, de a szállítás után 71%-ra csökkent.Az eredményt a 3. ábra mutatja.
3. ábra Az AdMSC-k életképességi eredményei (szállítás előtt és után)
Az átmérőt és az aggregációt is Countstar Rigel határozta meg.Az AdMSC-k átmérője drasztikusan megváltozott a szállítás után a szállítás előttihez képest.Az átmérő a szállítás előtt 19 µm volt, de a szállítás után 21 µm-re nőtt.A szállítás előtti összesítés 20%, de a szállítás után 25%-ra nőtt.A Countstar Rigel által rögzített képek alapján az AdMSC-k fenotípusa drasztikusan megváltozott a szállítás után.Az eredményeket a 4. ábra mutatja.
4. ábra: Az átmérő és az összesítési eredmények.V: Az AdMSC-k reprezentatív képei, az AdMSC-k fenotípusa drasztikusan megváltozott a szállítás után.B: A szállítás előtti összesítés 20%, de a szállítás után 25%-ra nőtt.C: Az átmérő a szállítás előtt 19 µm volt, de a szállítás után 21 µm-re nőtt.
Határozza meg az AdMSC-k immunfenotípusát Countstar Rigel segítségével
Az AdMSC-k immunfenotípusát Countstar Rigel határozta meg, az AdMSC-ket különböző antitestekkel (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR) inkubáltuk.Egy jel-szín alkalmazási eljárást hoztak létre úgy, hogy egy zöld csatornát a kép PE fluoreszcenciájára, valamint egy világos mezőre állítottak be.A fényes mező képreferencia-szegmentációját maszkként alkalmaztuk a PE fluoreszcencia jel mintavételéhez.A CD105 eredményeit mutattuk be (5. ábra).
5. ábra: Az AdMSC-k CD105-eredményeit a Countstar Rigel határozta meg.V: A CD105 pozitív százalékos arányának kvantitatív elemzése különböző mintákban FCS express 5 plus szoftverrel.B: A kiváló minőségű képek további morfológiai információkat szolgáltatnak.C: Minden egyes sejt miniatűrjei alapján validált eredmények, az FCS szoftvereszközök a sejteket különböző csoportokba osztották a változó fehérje expressziójuk szerint.
Az egyéb antitestek eredményeit a 6. ábra mutatja
6. ábra: A: A tipikus orsó alakú morfológiájú ASC-k reprezentatív képe.OLYMPUS mikroszkóppal rögzítették.Eredeti nagyítás, (10x).B: Az ASC-k adipogén differenciálódását a ruténiumvörös festés bizonyítja, amely mineralizációs területeket mutat.OLYMPUS mikroszkóppal rögzítették.Eredeti nagyítás (10x).C: Az ASC-k Countstar FL jellemzése.
Összegzés:
A Countstar FL képes nyomon követni ezen őssejtek koncentrációját, életképességét és fenotípus jellemzőit (és ezek változását) ezen őssejtek termelése és differenciálódása során.Az FCS express biztosítja az összes jelcella áttekintését, az adatok képen keresztüli érvényesítését.A felhasználó magabiztosan végezheti el a következő kísérleteket a Countstar Rigel eredményei alapján.A Countstar Rigel gyors, kifinomult és megbízható módszert kínál az őssejtek minőség-ellenőrzésére.
