Résumé: Les cellules souches mésenchymateuses sont un sous-ensemble de cellules souches pluripotentes qui peuvent être isolées du mésoderme.Avec leurs caractéristiques de renouvellement d'auto-réplication et de différenciation multidirectionnelle, ils possèdent un potentiel élevé pour diverses thérapies en médecine.Les cellules souches mésenchymateuses ont un phénotype immunitaire unique et une capacité de régulation immunitaire.Par conséquent, les cellules souches mésenchymateuses sont déjà largement utilisées dans les greffes de cellules souches, l'ingénierie tissulaire et la transplantation d'organes.Et au-delà de ces applications, elles sont utilisées comme un outil idéal en ingénierie tissulaire en tant que cellules semeuses dans une série d'expériences de recherche fondamentale et clinique.Jusqu'à présent, il n'existe pas de méthode et de norme largement acceptées pour le contrôle de la qualité des cellules souches mésenchymateuses.Le peut surveiller la concentration, la viabilité et les caractéristiques phénotypiques (et leurs modifications) pendant la production et la différenciation de ces cellules souches.Le a également l'avantage d'obtenir des informations morphologiques supplémentaires, fournies par les enregistrements d'images permanents en fond clair et en fluorescence pendant tout le processus de surveillance de la qualité des cellules.Le offre une méthode rapide, sophistiquée et fiable pour le contrôle qualité des cellules souches.
Matériaux et méthodes:
Les cellules souches mésenchymateuses dérivées de l'adipose (AdMSC) ont été offertes par le professeur Nianmin Qi, solution de coloration AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Anticorps : CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (société BD).
Les AdMSC ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 37℃, 5% de CO2.Digérer avec de la trypsine avant utilisation.
La procédure de coloration du marqueur CD a été suivie comme le manuel de l'anticorps.
Détection de marqueur de CD avec Countstar Rigel :
1. Une procédure d'application de couleur de signal a été créée en réglant le canal PE pour imager la fluorescence PE.
2. 3 champs ont été capturés dans chaque chambre.
3. Une fois l'imagerie et l'analyse initiale terminées, le réglage du seuil (log gate) pour la transfection positive et négative a été défini par le logiciel FCS.
Contrôle qualité des cellules souches
La figure suivante (Figure 1) montre la procédure de thérapie par cellules souches .
Figure 1 : La procédure de thérapie par cellules souches
Résultats:
Détermination de la concentration, de la viabilité, du diamètre et de l'agrégation des AdMSC.
La viabilité des AdMSC a été déterminée par AO/PI, une procédure d'application bicolore a été créée en réglant le canal vert et le canal rouge sur l'image de fluorescence AO et PI, plus un champ lumineux.Des exemples d'images ont été présentés à la figure 2.
Figure 2. Images d'avant le transport et après le transport des AdMSC.A. Avant le transport ;une image représentative est affichée.B. Après le transport ;une image représentative est affichée.
La viabilité des AdMSC a été radicalement modifiée après le transport par rapport à avant le transport.La viabilité avant transport était de 92 %, mais elle a été réduite à 71 % après transport.Le résultat a été montré dans la figure 3.
Figure 3. Les résultats de viabilité des AdMSC (avant transport et après transport)
Le diamètre et l'agrégation ont également été déterminés par .Le diamètre des AdMSC a été radicalement modifié après le transport par rapport à avant le transport.Le diamètre avant le transport était de 19 µm, mais il a augmenté à 21 µm après le transport.L'agrégation avant le transport était de 20 %, mais elle est passée à 25 % après le transport.D'après les images capturées par , le phénotype des AdMSC a été radicalement modifié après le transport.Les résultats ont été présentés à la figure 4.
Figure 4 : Les résultats de diamètre et d'agrégation.A: Les images représentatives des AdMSC, le phénotype des AdMSC ont été radicalement modifiés après le transport.B : L'agrégation avant le transport était de 20 %, mais elle est passée à 25 % après le transport.C : Le diamètre avant le transport était de 19 µm, mais il a augmenté à 21 µm après le transport.
Déterminer l'immunophénotype des AdMSC par Countstar Rigel
L'immunophénotype des AdMSC a été déterminé par , les AdMSC ont été incubés avec différents anticorps respectivement (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Une procédure d'application de couleur de signal a été créée en définissant un canal vert pour imager la fluorescence PE, plus un champ lumineux.Une segmentation de référence d'image en champ clair a été appliquée comme masque pour échantillonner le signal de fluorescence PE.Les résultats de CD105 ont été présentés (Figure 5).
Figure 5 : Les résultats CD105 des AdMSC ont été déterminés par .A : Analyse quantitative du pourcentage positif de CD105 dans différents échantillons par le logiciel FCS express 5 plus.B : Des images de haute qualité fournissent des informations morphologiques supplémentaires.C : Résultats validés par des vignettes de chaque cellule, les outils logiciels FCS ont divisé les cellules en différents groupes en fonction de leur expression protéique variable.
D'autres résultats d'anticorps ont été montrés dans la figure 6
Figure 6 : A : Une image représentative des ASC avec une morphologie typique en forme de fuseau.Capturé par le microscope OLYMPUS.Grossissement d'origine, (10x).B : La différenciation adipogénique des ASC est mise en évidence par une coloration au rouge de ruthénium montrant des zones de minéralisation.Capturé par le microscope OLYMPUS.Grossissement d'origine (10x).C : FL des ASC.
Sommaire:
Le Countstar FL peut surveiller la concentration, la viabilité et les caractéristiques phénotypiques (et leurs modifications) pendant la production et la différenciation de ces cellules souches.FCS express fournit la fonction pour examiner chaque cellule de signal, valider les données à travers l'image.L'utilisateur peut également avoir la confiance nécessaire pour effectuer les prochaines expériences basées sur les résultats de .Le offre une méthode rapide, sophistiquée et fiable pour le contrôle qualité des cellules souches.
