Abstrakt: Mesenchymale Stammzellen sind eine Untergruppe pluripotenter Stammzellen, die aus dem Mesoderm isoliert werden können.Mit ihren Selbstreplikations-Erneuerungs- und multidirektionalen Differenzierungseigenschaften besitzen sie ein hohes Potenzial für verschiedene Therapien in der Medizin.Mesenchymale Stammzellen haben einen einzigartigen Immunphänotyp und eine Fähigkeit zur Immunregulation.Daher werden mesenchymale Stammzellen bereits vielfach in der Stammzelltransplantation, im Tissue Engineering und in der Organtransplantation eingesetzt.Und über diese Anwendungen hinaus werden sie als ideales Werkzeug in der Gewebezüchtung als Seeder-Zellen in einer Reihe von Grundlagen- und klinischen Forschungsexperimenten verwendet.Bisher gibt es keine allgemein akzeptierte Methode und keinen Standard für die Qualitätskontrolle von mesenchymalen Stammzellen.Der Countstar Rigel kann die Konzentration, Lebensfähigkeit und Phänotypeigenschaften (und deren Veränderungen) während der Produktion und Differenzierung dieser Stammzellen überwachen.Der Countstar Rigel hat auch den Vorteil, zusätzliche morphologische Informationen zu gewinnen, die durch die permanenten Hellfeld- und fluoreszenzbasierten Bildaufzeichnungen während des gesamten Prozesses der Zellqualitätsüberwachung geliefert werden.Der Countstar Rigel bietet eine schnelle, ausgeklügelte und zuverlässige Methode zur Qualitätskontrolle von Stammzellen.
Materialen und Methoden:
Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (AdMSCs) wurden von Professor Nianmin Qi, AO/PI-Färbelösung (Shanghai RuiYu, CF002) geschenkt.Antikörper: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSCs wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.Vor Gebrauch mit Trypsin verdauen.
Das CD-Marker-Färbeverfahren wurde wie im Handbuch des Antikörpers befolgt.
CD-Marker-Erkennung mit Countstar Rigel:
1. Ein Verfahren zum Aufbringen von Signalfarben wurde erstellt, indem der PE-Kanal so eingestellt wurde, dass er PE-Fluoreszenz abbildet.
2. 3 Felder wurden von jeder Kammer erfasst.
3. Nachdem die Bildgebung und die anfängliche Analyse abgeschlossen waren, wurde die Schwellenwerteinstellung (Log-Gate) für positive und negative Transfektion durch die FCS-Software eingestellt.
Qualitätskontrolle von Stammzellen
Die folgende Abbildung (Abbildung 1) zeigt das Verfahren von Stammzellen Therapie .
Abbildung 1: Das Verfahren zur Stammzelltherapie
Ergebnisse:
Bestimmung der Konzentration, Lebensfähigkeit, des Durchmessers und der Aggregation von AdMSCs.
Die Lebensfähigkeit von AdMSCs wurde durch AO/PI bestimmt. Ein zweifarbiges Auftragungsverfahren wurde erstellt, indem der grüne Kanal und der rote Kanal eingestellt wurden, um AO- und PI-Fluoreszenz sowie ein Hellfeld abzubilden.Beispielbilder wurden in Abbildung 2 gezeigt.
Abbildung 2. Bilder von AdMSCs vor und nach dem Transport.A. Vor dem Transport;ein repräsentatives Bild wird angezeigt.B. Nach dem Transport;ein repräsentatives Bild wird angezeigt.
Die Lebensfähigkeit von AdMSCs war nach dem Transport im Vergleich zu vor dem Transport drastisch verändert.Die Lebensfähigkeit vor dem Transport betrug 92 %, verringerte sich jedoch nach dem Transport auf 71 %.Das Ergebnis ist in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3. Die Lebensfähigkeitsergebnisse von AdMSCs (vor dem Transport und nach dem Transport)
Der Durchmesser und die Aggregation wurden ebenfalls von Countstar Rigel bestimmt.Der Durchmesser von AdMSCs wurde nach dem Transport im Vergleich zu vor dem Transport drastisch verändert.Der Durchmesser vor dem Transport betrug 19 µm, stieg aber nach dem Transport auf 21 µm an.Die Aggregation vor dem Transport betrug 20 %, stieg aber nach dem Transport auf 25 %.Aus den von Countstar Rigel aufgenommenen Bildern geht hervor, dass sich der Phänotyp von AdMSCs nach dem Transport drastisch verändert hat.Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 4: Durchmesser und Aggregationsergebnisse.A: Die repräsentativen Bilder von AdMSCs, der Phänotyp von AdMSCs wurden nach dem Transport drastisch verändert.B: Die Aggregation vor dem Transport betrug 20 %, stieg aber nach dem Transport auf 25 % an.C: Der Durchmesser vor dem Transport betrug 19 µm, stieg aber nach dem Transport auf 21 µm an.
Bestimmen Sie den Immunphänotyp von AdMSCs von Countstar Rigel
Der Immunphänotyp von AdMSCs wurde von Countstar Rigel bestimmt, AdMSCs wurden mit jeweils unterschiedlichen Antikörpern (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR) inkubiert.Ein Verfahren zum Aufbringen von Signalfarben wurde erstellt, indem ein grüner Kanal eingestellt wurde, um PE-Fluoreszenz abzubilden, plus ein helles Feld.Eine Hellfeldbild-Referenzsegmentierung wurde als Maske angewendet, um das PE-Fluoreszenzsignal abzutasten.Die Ergebnisse von CD105 wurden gezeigt (Abbildung 5).
Abbildung 5: CD105-Ergebnisse von AdMSCs wurden von Countstar Rigel bestimmt.A: Quantitative Analyse des positiven Prozentsatzes von CD105 in verschiedenen Proben durch FCS express 5 plus Software.B: Hochwertige Bilder liefern zusätzliche morphologische Informationen.C: Validierte Ergebnisse durch Miniaturansichten jeder einzelnen Zelle, die FCS-Softwaretools teilten die Zellen entsprechend ihrer unterschiedlichen Proteinexpression in verschiedene Gruppen ein.
Andere Antikörper-Ergebnisse sind in Abb. 6 gezeigt
Abbildung 6: A: Ein repräsentatives Bild von ASCs mit typischer spindelförmiger Morphologie.Aufgenommen mit dem OLYMPUS-Mikroskop.Originalvergrößerung (10x).B: Die adipogene Differenzierung von ASCs wird durch Rutheniumrot-Färbung belegt, die Mineralisierungsbereiche zeigt.Aufgenommen mit dem OLYMPUS-Mikroskop.Originalvergrößerung (10x).C: Countstar FL Charakterisierung von ASCs.
Zusammenfassung:
Der Countstar FL kann die Konzentration, Lebensfähigkeit und Phänotypeigenschaften (und deren Veränderungen) während der Produktion und Differenzierung dieser Stammzellen überwachen.FCS Express bietet die Funktion, jede Signalzelle zu überprüfen und die Daten durch das Bild zu validieren.Der Benutzer kann sich auch darauf verlassen, die nächsten Experimente auf der Grundlage der Ergebnisse von Countstar Rigel durchzuführen.Der Countstar Rigel bietet eine schnelle, ausgeklügelte und zuverlässige Methode zur Qualitätskontrolle von Stammzellen.
