Astratto: Le cellule staminali mesenchimali sono un sottoinsieme di cellule staminali pluripotenti che possono essere isolate dal mesoderma.Con le loro caratteristiche di rinnovamento dell'autoreplicazione e differenziazione multidirezionale, possiedono un alto potenziale per varie terapie in medicina.Le cellule staminali mesenchimali hanno un fenotipo immunitario unico e una capacità di regolazione immunitaria.Pertanto, le cellule staminali mesenchimali sono già ampiamente utilizzate nei trapianti di cellule staminali, nell'ingegneria dei tessuti e nei trapianti di organi.E oltre a queste applicazioni, sono utilizzati come strumento ideale nell'ingegneria dei tessuti come cellule seminatrici in una serie di esperimenti di ricerca clinica e di base.Finora non esiste un metodo e uno standard ampiamente accettati per il controllo di qualità delle cellule staminali mesenchimali.Il Countstar Rigel può monitorare la concentrazione, la vitalità e le caratteristiche fenotipiche (e le loro modifiche) durante la produzione e la differenziazione di queste cellule staminali.Il Countstar Rigel ha anche il vantaggio di ottenere informazioni morfologiche aggiuntive, fornite dal campo chiaro permanente e dalle registrazioni di immagini basate sulla fluorescenza durante l'intero processo di monitoraggio della qualità cellulare.Il Countstar Rigel offre un metodo veloce, sofisticato e affidabile per il controllo della qualità delle cellule staminali.
Materiali e metodi:
Le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) sono state donate dal professor Nianmin Qi, soluzione di colorazione AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Anticorpo: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (società BD).
Gli AdMSC sono stati coltivati in un incubatore umidificato a 37 ℃, 5% di CO2.Digerire con tripsina prima dell'uso.
La procedura di colorazione del marker CD è stata seguita come manuale dell'anticorpo.
Rilevamento del marker CD con Countstar Rigel:
1. È stata creata una procedura di applicazione del colore del segnale impostando il canale PE sulla fluorescenza PE dell'immagine.
2. 3 campi sono stati catturati da ciascuna camera.
3. Dopo aver completato l'imaging e l'analisi iniziale, l'impostazione della soglia (loggate) per la trasfezione positiva e negativa è stata impostata dal software FCS.
Controllo di qualità delle cellule staminali
La figura seguente (Figura 1) mostra la procedura di terapia con cellule staminali .
Figura 1: La procedura per la terapia con cellule staminali
Risultati:
Determinazione della concentrazione, vitalità, diametro e aggregazione di AdMSC.
La fattibilità degli AdMSC è stata determinata da AO/PI, è stata creata una procedura di applicazione a doppio colore impostando il canale verde e il canale rosso per visualizzare la fluorescenza AO e PI, oltre a un campo luminoso.Immagini di esempio sono state mostrate nella Figura 2.
Figura 2. Immagini prima del trasporto e dopo il trasporto di AdMSC.A. Prima del trasporto;viene mostrata un'immagine rappresentativa.B. Dopo il trasporto;viene mostrata un'immagine rappresentativa.
La fattibilità degli AdMSC è stata cambiata drasticamente dopo il trasporto rispetto a prima del trasporto.La fattibilità prima del trasporto era del 92%, ma si è ridotta al 71% dopo il trasporto.Il risultato è stato mostrato in Figura 3.
Figura 3. I risultati di fattibilità degli AdMSC (Prima del trasporto e dopo il trasporto)
Anche il diametro e l'aggregazione sono stati determinati da Countstar Rigel.Il diametro degli AdMSC è stato cambiato drasticamente dopo il trasporto rispetto a prima del trasporto.Il diametro prima del trasporto era di 19 µm, ma è aumentato a 21 µm dopo il trasporto.L'aggregazione prima del trasporto era del 20%, ma è aumentata al 25% dopo il trasporto.Dalle immagini catturate da Countstar Rigel, il fenotipo degli AdMSC è stato cambiato drasticamente dopo il trasporto.I risultati sono stati mostrati nella Figura 4.
Figura 4: il diametro e i risultati dell'aggregazione.R: Le immagini rappresentative degli AdMSC, il fenotipo degli AdMSC sono stati modificati drasticamente dopo il trasporto.B: L'aggregazione prima del trasporto era del 20%, ma è aumentata al 25% dopo il trasporto.C: Il diametro prima del trasporto era di 19 µm, ma è aumentato a 21 µm dopo il trasporto.
Determinare l'immunofenotipo di AdMSC da Countstar Rigel
L'immunofenotipo degli AdMSC è stato determinato da Countstar Rigel, gli AdMSC sono stati incubati rispettivamente con anticorpi diversi (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).È stata creata una procedura di applicazione del colore del segnale impostando un canale verde per l'immagine della fluorescenza PE, oltre a un campo luminoso.La segmentazione di riferimento dell'immagine in campo chiaro è stata applicata come maschera per campionare il segnale di fluorescenza PE.Sono stati mostrati i risultati di CD105 (Figura 5).
Figura 5: i risultati CD105 di AdMSC sono stati determinati da Countstar Rigel.A: Analisi quantitativa della percentuale positiva di CD105 in diversi campioni mediante il software FCS express 5 plus.B: Le immagini di alta qualità forniscono ulteriori informazioni morfologiche.C: i risultati convalidati dalle miniature di ogni singola cellula, gli strumenti software FCS hanno diviso le cellule in gruppi diversi in base alla loro espressione proteica variabile.
Altri risultati di anticorpi sono stati mostrati in Fig 6
Figura 6: A: Un'immagine rappresentativa di ASC con tipica morfologia a forma di fuso.Catturato dal microscopio OLYMPUS.Ingrandimento originale, (10x).B: La differenziazione adipogenica delle ASC è evidenziata dalla colorazione rosso rutenio che mostra aree di mineralizzazione.Catturato dal microscopio OLYMPUS.Ingrandimento originale (10x).C: Caratterizzazione di Countstar FL di ASC.
Riepilogo:
Il Countstar FL può monitorare la concentrazione, la vitalità e le caratteristiche fenotipiche (e le loro modifiche) durante la produzione e la differenziazione di queste cellule staminali.FCS express fornisce la funzione per rivedere ogni cella di segnale, convalidare i dati attraverso l'immagine.L'utente può anche avere la sicurezza di eseguire i prossimi esperimenti sulla base dei risultati di Countstar Rigel.Il Countstar Rigel offre un metodo veloce, sofisticato e affidabile per il controllo della qualità delle cellule staminali.
