एक उपन्यास इमेजिंग साइटोमेट का उपयोग करके स्टेम सेल की प्रत्यक्ष एकाग्रता, व्यवहार्यता और फेनोटाइप मापन

सार: मेसेनकाइमल स्टेम सेल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एक सबसेट है जिसे मेसोडर्म से अलग किया जा सकता है।उनके स्व-प्रतिकृति नवीनीकरण और बहु-दिशा विभेदन विशेषताओं के साथ, वे चिकित्सा में विभिन्न उपचारों के लिए एक उच्च क्षमता रखते हैं।मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं में एक अद्वितीय प्रतिरक्षा फेनोटाइप और प्रतिरक्षा विनियमन क्षमता होती है।इसलिए, स्टेम सेल प्रत्यारोपण, ऊतक इंजीनियरिंग और अंग प्रत्यारोपण में मेसेनकाइमल स्टेम सेल पहले से ही व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं।और इन अनुप्रयोगों से परे, वे ऊतक इंजीनियरिंग में एक आदर्श उपकरण के रूप में बुनियादी और नैदानिक ​​अनुसंधान प्रयोगों की एक श्रृंखला में बीजक कोशिकाओं के रूप में उपयोग किए जाते हैं।अब तक, मेसेनकाइमल स्टेम सेल के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए व्यापक रूप से स्वीकृत विधि और मानक नहीं है।काउंटस्टार रिगेल इन स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन और भेदभाव के दौरान एकाग्रता, व्यवहार्यता और फेनोटाइप विशेषताओं (और उनके परिवर्तन) की निगरानी कर सकता है।काउंटस्टार रिगेल को सेल गुणवत्ता निगरानी की पूरी प्रक्रिया के दौरान स्थायी ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस-आधारित छवि रिकॉर्डिंग द्वारा प्रदान की गई अतिरिक्त रूपात्मक जानकारी प्राप्त करने में भी फायदा है।काउंटस्टार रिगेल स्टेम सेल के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक तेज़, परिष्कृत और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है।

सामग्री और तरीके:
वसा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (AdMSCs) को प्रोफेसर नियानमिन क्यूई, AO / PI धुंधला समाधान (शंघाई रुईयू, CF002) द्वारा उपहार में दिया गया था।एंटीबॉडी: सीडी29, सीडी34, सीडी45, सीडी56, सीडी73, सीडी105, एचएलएडीआर (बीडी कंपनी)।
AdMSCs को 37 ℃, 5% CO2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था।उपयोग करने से पहले ट्रिप्सिन के साथ डाइजेस्ट करें।
एंटीबॉडी के मैनुअल के रूप में सीडी मार्कर धुंधला प्रक्रिया का पालन किया गया था।
काउंटस्टार रिगेल के साथ सीडी मार्कर डिटेक्शन:
1. पीई चैनल को छवि पीई फ्लोरेसेंस पर सेट करके एक सिग्नल-रंग अनुप्रयोग प्रक्रिया बनाई गई थी।
2. प्रत्येक कक्ष से 3 फ़ील्ड कैप्चर किए गए।
3. इमेजिंग और प्रारंभिक विश्लेषण पूरा होने के बाद, एफसीएस सॉफ्टवेयर द्वारा सकारात्मक और नकारात्मक अभिकर्मक के लिए थ्रेशोल्ड (लॉग गेट) सेटिंग निर्धारित की गई थी।

स्टेम सेल का गुणवत्ता नियंत्रण
निम्नलिखित चित्र (चित्र 1) की प्रक्रिया को दर्शाता है: स्टेम सेल थेरेपी .

चित्र 1: स्टेम सेल थेरेपी की प्रक्रिया

परिणाम:
AdMSCs की एकाग्रता, व्यवहार्यता, व्यास और एकत्रीकरण का निर्धारण।
AdMSCs की व्यवहार्यता AO / PI द्वारा निर्धारित की गई थी, AO और PI प्रतिदीप्ति की छवि के लिए ग्रीन चैनल और रेड चैनल, साथ ही एक उज्ज्वल क्षेत्र की स्थापना करके एक दोहरे रंग की आवेदन प्रक्रिया बनाई गई थी।उदाहरण चित्र चित्र 2 में दिखाए गए थे।

चित्रा 2. परिवहन से पहले और AdMSCs के परिवहन के बाद की छवियां।ए परिवहन से पहले;एक प्रतिनिधि छवि दिखाया गया है।बी परिवहन के बाद;एक प्रतिनिधि छवि दिखाया गया है।

परिवहन से पहले की तुलना में परिवहन के बाद AdMSCs की व्यवहार्यता में भारी बदलाव आया।परिवहन से पहले व्यवहार्यता 92% थी, लेकिन परिवहन के बाद यह घटकर 71% रह गई।परिणाम चित्र 3 में दिखाया गया था।

चित्र 3. AdMSCs के व्यवहार्यता परिणाम (परिवहन से पहले और परिवहन के बाद)

व्यास और एकत्रीकरण भी काउंटस्टार रिगेल द्वारा निर्धारित किए गए थे।परिवहन से पहले की तुलना में परिवहन के बाद AdMSCs के व्यास में भारी बदलाव आया।परिवहन से पहले व्यास 19μm था, लेकिन परिवहन के बाद यह बढ़कर 21μm हो गया।परिवहन से पहले का एकत्रीकरण 20% था, लेकिन परिवहन के बाद यह बढ़कर 25% हो गया।काउंटस्टार रिगेल द्वारा कैप्चर की गई छवियों से, परिवहन के बाद AdMSCs के फेनोटाइप में भारी बदलाव किया गया।परिणाम चित्र 4 में दिखाए गए थे।

चित्र 4: व्यास और एकत्रीकरण परिणाम।ए: परिवहन के बाद AdMSCs के प्रतिनिधि चित्र, AdMSCs के फेनोटाइप को काफी बदल दिया गया था।बी: परिवहन से पहले एकत्रीकरण 20% था, लेकिन परिवहन के बाद यह बढ़कर 25% हो गया।सी: परिवहन से पहले का व्यास 19μm था, लेकिन परिवहन के बाद यह बढ़कर 21μm हो गया।

काउंटस्टार रिगेल द्वारा AdMSCs के इम्यूनोफेनोटाइप का निर्धारण करें
AdMSCs के इम्यूनोफेनोटाइप को काउंटस्टार रिगेल द्वारा निर्धारित किया गया था, AdMSCs को क्रमशः अलग-अलग एंटीबॉडी (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR) के साथ जोड़ा गया था।एक ग्रीन चैनल को छवि PE प्रतिदीप्ति, साथ ही एक उज्ज्वल क्षेत्र में सेट करके एक सिग्नल-रंग अनुप्रयोग प्रक्रिया बनाई गई थी।पीई प्रतिदीप्ति संकेत के नमूने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र चित्र संदर्भ विभाजन को मास्क के रूप में लागू किया गया था।CD105 के परिणाम दिखाए गए (चित्र 5)।

चित्र 5: AdMSCs के CD105 परिणाम काउंटस्टार रिगेल द्वारा निर्धारित किए गए थे।ए: एफसीएस एक्सप्रेस 5 प्लस सॉफ्टवेयर द्वारा विभिन्न नमूनों में सीडी105 के सकारात्मक प्रतिशत का मात्रात्मक विश्लेषण।बी: उच्च-गुणवत्ता वाली छवियां अतिरिक्त रूपात्मक जानकारी प्रदान करती हैं।सी: हर एक सेल के थंबनेल द्वारा मान्य परिणाम, एफसीएस सॉफ्टवेयर टूल्स ने कोशिकाओं को उनकी अलग-अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुसार अलग-अलग समूहों में विभाजित किया।

अन्य एंटीबॉडी परिणाम चित्र 6 में दिखाए गए थे

चित्र 6: ए: विशिष्ट धुरी के आकार की आकृति विज्ञान के साथ एएससी की एक प्रतिनिधि छवि।ओलंपस माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर किया गया।मूल आवर्धन, (10x)।बी: एएससी के एडिपोजेनिक भेदभाव रूथेनियम रेड स्टेनिंग द्वारा खनिज के क्षेत्रों को दर्शाने वाले क्षेत्रों से प्रकट होता है।ओलंपस माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर किया गया।मूल आवर्धन (10x)।सी: एएससी के काउंटस्टार एफएल लक्षण वर्णन।

सारांश:
काउंटस्टार एफएल इन स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन और भेदभाव के दौरान एकाग्रता, व्यवहार्यता और फेनोटाइप विशेषताओं (और उनके परिवर्तन) की निगरानी कर सकता है।एफसीएस एक्सप्रेस प्रत्येक सिग्नल सेल की समीक्षा करने के लिए फ़ंक्शन की आपूर्ति करता है, छवि के माध्यम से डेटा को मान्य करता है।उपयोगकर्ता में काउंटस्टार रिगेल परिणामों के आधार पर अगले प्रयोग करने का विश्वास भी हो सकता है।काउंटस्टार रिगेल स्टेम सेल के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक तेज़, परिष्कृत और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है।