Il conteggio a doppia fluorescenza AOPI è il tipo di test utilizzato per rilevare la concentrazione e la vitalità cellulare.La soluzione è una combinazione di acridina arancione (il colorante verde fluorescente dell'acido nucleico) e ioduro di propidio (il colorante rosso fluorescente dell'acido nucleico).Lo ioduro di propidio (PI) è un colorante di esclusione della membrana che entra solo nelle cellule con membrane compromesse, mentre l'arancio di acridina è in grado di penetrare in tutte le cellule di una popolazione.Quando entrambi i coloranti sono presenti nel nucleo, lo ioduro di propidio provoca una riduzione della fluorescenza arancione di acridina mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).Di conseguenza, le cellule nucleate con membrane intatte si colorano di verde fluorescente e vengono conteggiate come vive, mentre le cellule nucleate con membrane compromesse si colorano solo di rosso fluorescente e vengono conteggiate come morte quando si utilizza il sistema Countstar® FL.I materiali non nucleati come globuli rossi, piastrine e detriti non emettono fluorescenza e vengono ignorati dal software Countstar® FL.
Processo di terapia con cellule staminali
Figura 4 Monitoraggio della vitalità e della conta cellulare delle cellule staminali mesenchimali (MSC) per l'uso nelle terapie cellulari.
Determinare la vitalità delle MSC mediante il test AO/PI e Trypan Blue
Figura 2. A. Immagine di MSC colorata da AO/PI e Trypan Blue;2. Confronto del risultato AO/PI e Trypan blue prima e dopo il trasporto.
L'indice di rifrazione cellulare cambia, la colorazione con Trypan Blue non era così ovvia, è difficile determinare la vitalità dopo il trasporto.Mentre la fluorescenza a doppio colore consente la colorazione di cellule nucleate vive e morte, generando risultati di vitalità accurati anche in presenza di detriti, piastrine e globuli rossi.
